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KM-P-0281 | 第一鏈式反轉錄試劑盒

貨號: KM-P-0281


名稱: 第一鏈式反轉錄試劑盒


規格:  50

¥900

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詳情

  • 產品儲存:-20℃ 保存,有效期12個月

  • 本制品以RNA為模板,采用預混合技術,用5×TRUE Reaction Mix(已經預混合了TRUEscript Hˉ RTase /RI Mix、5×RT Reaction Mix)高效合成第一鏈cDNA,操作簡單。

本制品以RNA為模板,采用預混合技術,用5×TRUE Reaction Mix(已經預混合了TRUEscript Hˉ RTase /RI Mix、5×RT Reaction Mix)高效合成第一鏈cDNA,操作簡單。

  • 適用范圍:第一鏈cDNA合成??捎糜诟呖截?、低拷貝基因的檢測。

  • 特點:合成cDNA片段長度最高可達12 kb。

  • 第一鏈cDNA合成(20 μl反應體系為例)

  1. 加入

Components

Volume

Total RNA/mRNA

50 ng-5 μg/5-500 ng

Oligo(dT)18(0.5 μg /μl)or

Random Primer(0.1 μg/μl) or

GSP(Gene Specific Primer)

1 μl

1 μl

2 pmol

5×TRUE Reaction Mix

3.6-4 μl (見注意事項4)

RNase free H2O to final volume

20 μl

注:真核生物mRNA帶Poly A尾和一些帶Poly A尾的病毒RNA,反轉錄引物可以選擇Oligo(dT)18,原核生物或者不帶Poly A尾的病毒mRNA無法使用Oligo dT,反轉錄引物只能選擇Random primer N6(隨機引物N6)。

2. 輕輕混勻

如用Oligo(dT)18或基因特異引物(GSP),42℃孵育30-50min。

如用Random Primer,25℃孵育10 min,42℃孵育30-50 min。

3. 85℃加熱5 秒鐘失活TRUEscript Hˉ RTase。

  • RT-PCR

    建議取1/10-1/5 體積(2-4 μl)的反轉錄產物作為PCR模板。

    建議PCR條件(50 μl反應體系為例)

Components

Volume

Final Concentration

cDNA Template

2 μl

as required

Forward Primer (10 μM)

1 μl

0.2 μM each

Reverse Primer (10 μM)

1 μl

0.2 μM each

10×Taq Buffer (Mg2+)

5 μl

2.5 mM dNTPs

4 μl

0.2 mM

Taq DNA Polymerase

0.5 μl

2.5 units

ddH2O to final volume

50 μl

Not applicable

PCR 循環

94 2-5 min

94 30 sec

50-60 30 sec 30-40 cycles

72 1-2 kb/min

725-10 min

注意事項:

  1. 避免RNase污染。

  2. 為保證反轉錄成功建議使用高質量的RNA樣品。

  3. 可選步驟(一般不需要):如果RNA模板GC含量豐富或者有復雜二級結構,可以先只加RNA模板、引物和和RNase free H2O混勻,65變性5分鐘,冰上冷卻,短暫離心后加入其它成分繼續下面的反轉錄步驟。

  4. 5×TRUE Reaction Mix非常粘稠,溶液容易吸附在管壁和吸頭外導致損失,用前請點甩離心后使用,并且避免吸頭外壁沾附損失。可以每次按照3.6-3.8μl使用,也不影響使用效果。

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